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　　鬼筆環(huán)肽的操作步驟：

　　1、工作液準(zhǔn)備：

　　本品以溶于甲醇的20μM儲(chǔ)存液形式提供，總量為300μl。按照100nM的工作液濃度來(lái)?yè)Q算，可制備總量為60ml的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對(duì)母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。現(xiàn)配現(xiàn)用。

 

　　2、染色步驟：

　　a、細(xì)胞爬片生長(zhǎng)24h，使其密度達(dá)到50%匯合度。

　　b、吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的1×PBS（pH7.4）清洗細(xì)胞2次。

　　c、使用溶于PBS的4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定10min。

　　d、室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

　　e、室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用0.5%TritonX-100溶液透化處理5min。

　　f、室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

　　g、取200μl配制好的FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育30min（通常情況下，4℃~37℃孵育皆可）。

　　h、用PBS清洗蓋玻片3次，每次5min。

　　i、使用200μlDAPI溶液（濃度：100nM）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約30s。

　　j、用PBS清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存，通常6個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。

　　k、熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，選擇FITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=496/516nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。